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Western Blot全流程實驗步驟及常見問題詳解
發(fā)布時間： 2024-03-20 點擊次數(shù)： 1765次
一、原理
蛋白質(zhì)免疫印跡法即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法，基本原理是經(jīng)過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。
二、流程圖：
(一)蛋白上清液提取：
a、準(zhǔn)備工作：分裝需要體積的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分別加蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：PMSF 體積比為100:1），磷酸化蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制劑體積比為100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制劑，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）體積比為 100:0.2；
b、剪取適量組織（盡量保證每一粒樣品都剪去的一樣多）和適量混勻的蛋白裂解液于勻漿器中磨勻（0.01g組織加上50-100ul的蛋白裂解液），直至看不見組織塊；
c、轉(zhuǎn)移勻漿液于 1.5ml 離心管中，置于冰上蛋白裂解10min；
d、提前開離心機預(yù)冷，4℃，12000rpm 離心 15min ；
e、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5ml 新的離心管中，部分用于實驗多余的存于-20℃；
若實驗對象為細(xì)胞：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞
懸浮細(xì)胞：
①收細(xì)胞：細(xì)胞懸液收集到離心管中，5000rpm，去上清，加1mlPBS，5000rpm，5min，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min；
②打蛋白：超聲儀，探頭使用前用純水清洗，探頭伸入液面以下，避免太多；設(shè)置程序：（打3s，停3s，共計92次）；破碎細(xì)胞后，4℃，12000rpm，10min離心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。
注意：
①貼壁細(xì)胞：先用PBS緩沖液清洗兩遍，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用細(xì)胞刮板將細(xì)胞+蛋白裂解液移至離心管中。
②一管細(xì)胞打20次左右，打蛋白的過程中會發(fā)熱，可暫停置于冰上數(shù)秒。
BCA測蛋白濃度：（通常利用BCA試劑盒測定），基本流程如下：
96孔板：（一般最外圍的孔不利用或加等體積的PBS溶液防止污染和蒸發(fā)）
（1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA做標(biāo)曲，取7個EP管，編號①-⑦
（2）濃度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（單位：mg/ml）
（3）②-⑦+50ulPBS，①-②+50ulBSA
（4）②混勻，取50ul加③，依次加到⑥
（5）配樣品濃度：45ulPBS+5ul樣品濃度，配完短暫離心混勻（計算濃度時×10）
（6）配制工作液，配完避光，現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=50:1，一個孔要200ul工作液）：一個樣要2個重復(fù)孔，計算體系：7個標(biāo)準(zhǔn)品+1個待測液溶液×2，共計16孔；防止加樣誤差，配置20個體系，一個200ul（20×200=4000ul/4ml）
（7）加樣到96孔板：一個孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液；標(biāo)準(zhǔn)品從⑦-①加，兩個平行孔一起加。
（8）37℃孵育30min（孔板底部勿觸碰，保持干凈）
測562nm處OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（excel）
圖1 37℃恒溫箱孵育后，下一步酶標(biāo)儀測定OD值 2、蛋白液變性 a 將上步蛋白上清液與 5×loading buffer 4:1 混勻， b 在沸水中煮 5min，水浴結(jié)束后，常溫離心（瞬離），制膠后用于上樣。 (二) 配膠 1、制膠：濃縮膠/上層（5%）；分離膠/下層（根據(jù)蛋白分子大小而定） （1）制膠前用純水檢漏，加入純水放置2-3min； （2）配制下層膠：試劑盒配置好的膠液靠邊注入玻璃板（盡量不要產(chǎn)生氣泡）；加入無水乙醇/雙蒸水壓平膠面，靜置等膠凝固（根據(jù)天氣室溫變化，一般30min以上）；配制上層膠：下層膠凝固后倒掉無水乙醇/雙蒸水，濾紙吸干，上層膠緩緩注入，插梳子，等待凝固（約1h） 
圖2 制膠完成后 分離膠范圍： 
(三)電泳
1、配制上樣體系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上樣量：20-50ug
2、上樣：最左和最右孔可加SDS-PAGE loading buffer壓平條帶；可與最中央或左右兩端各加入3-5ul的蛋白maker；蛋白樣品上樣（9ul） 
圖3、4 上樣，80v電壓 
圖5 蛋白maker分離 3、將膠置于電泳槽中，倒入電泳緩沖液，內(nèi)部要漫過矮板，外部要漫過玻璃板底部； 4、準(zhǔn)備樣品 maker 于冰盒上，順序排好，上樣，并在實驗本上記錄好； 5、蓋上電源蓋，正負(fù)極相互對應(yīng)，接通電源，恒壓濃縮膠80V，30min或maker分離后可更改電壓為120v，跑分離膠。待 loading buffer中的溴酚藍(lán)跑至腳底部 1cm 處停止電泳。整個時間大概為 1.5h-2h。
(四) 轉(zhuǎn)膜 1、根據(jù) maker 的指示，分別切出對應(yīng)需要分子量蛋白的膠；并用尺子量取膠的寬度； 2、準(zhǔn)備6張與膠同樣大小的濾紙和1張NC膜一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至浸透。使用PVDF膜需要用甲醇激活。 3、按照3張濾紙，膜，膠，3張濾紙的順序依次放好，要求中間沒有氣泡。將電泳夾輕輕夾緊，放入電泳儀中，要求膠靠近負(fù)極（電泳儀中的黑色一面）膜 靠近正極（電泳儀中紅色一面），倒入電泳緩沖液沒過有膠的地方。 4、蓋上電源蓋，接通電源，轉(zhuǎn)膜，不同的分子量轉(zhuǎn)膜時間不同；（例如300mA，1h,20-25KD） 注意： ①黑面朝上，組裝結(jié)構(gòu)為：（黑）海綿—濾紙（2-3張）—膠—膜—濾紙（2-3張濾紙）—海綿（紅or白）。如下圖： 
圖6 “三明治"組裝順序 ②轉(zhuǎn)模槽需埋入冰中，防止轉(zhuǎn)膜過程中甲醇產(chǎn)熱溫度過高。 
(五) 封閉 配制 5%脫脂牛奶，質(zhì)量體積比為1g脫脂奶粉：20ml 1×TBST 。將轉(zhuǎn)完后的膜用 5%脫脂牛奶封閉至少1h。 
裁膜孵育抗體：（注意：一些期刊雜志現(xiàn)在不允許裁膜） (六) 一抗孵育 1、配置抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書的要求配置，稀釋液一般為一抗稀釋液。 孵育時間根據(jù)季節(jié)溫度變化，夏天：4℃過夜，第二天室溫?fù)u床30~60min，直至抗體溫度為室溫； 冬天：室溫?fù)u床 60min~180min，4℃過夜，第二天室溫?fù)u床60-120min，直至抗體恢復(fù)到室溫。 2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。
(七) 二抗孵育 1、配置抗體，稀釋液為 1×TBST，比例需根據(jù)說明書要求大概為 1:3000~1：4000。 孵育時間為，夏天：室溫?fù)u床 30-60min；冬天：室溫?fù)u床 60min-180min。 2、 洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。 注意：一抗，二抗孵育洗膜時間可以靈活調(diào)整，一般3-5次，5min一次
(八) 顯影曝光 1、試劑盒A液+B液現(xiàn)配現(xiàn)用（A:B=1:1），避光保存； 2、夾起膜放入玻璃皿中，吸顯影液滴在膜上，確保顯影液浸潤到了膜所有地方； 3、image Lab曝光步驟：膜放置皿中（小口徑玻璃皿中）—打開儀器（image lab）,膜放入機器—選擇印跡—colorimetic—自動曝光—拍白光圈 4、曝光拍照（CHEMI）—選擇“放置凝膠"——設(shè)置曝光時間（自動or手動）—凝膠成像—保存 注意：一抗原液（1:1000）稀釋，若顯影條帶較暗可適當(dāng)提高比例如1:500 Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀釋液
注意事項 1 、條帶形狀成彎狀可能原因有： （1）跑膠電泳過程發(fā)熱，電泳需要低溫； （2）轉(zhuǎn)膜電泳過程發(fā)熱，轉(zhuǎn)膜需要低溫；轉(zhuǎn)膜過程上下層濾紙接觸，會導(dǎo) 致局部短路，也散發(fā)熱量。
2、條帶畸形最主要可能是膠沒有混勻，轉(zhuǎn)膜過程中膠與膜中間有氣泡。條
帶拖尾，應(yīng)該是蛋白雜質(zhì)較多。
3、 配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看
似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒或疙瘩，可能會導(dǎo)致在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。
4、背景深
（1）封閉問題，牛奶液體沒有覆蓋膜； （2）降低一抗?jié)舛龋跤龝r間； （3）縮短二抗孵育時間；
5 、沒有條帶
首先利用麗春紅對膜染色，若有條帶在，就說明是轉(zhuǎn)膜后面的封閉一抗二抗操作有問題，我們可通過調(diào)節(jié)后面的實驗條件，重新對膜進(jìn)行處理，最后還是沒出不排除一抗有問題； 若麗春紅染色沒有條帶，則可以放棄此膜，轉(zhuǎn)膜前面的步驟哪里出錯，有可能蛋白濃度低或蛋白未提出。
6 、曝光過后，若是β-actin 這樣的內(nèi)參很明顯的降解成了兩條帶，則說明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巰基乙醇這類的還原劑失效。
GAPDH內(nèi)參不齊，可能是一抗使用多次，更換新的一抗，或者是上樣量的問題。 7、對于特殊的分子量如小于10KD，大于300KD 的蛋白，久未做出，可選擇更改膜的品種，如 PVDF 膜，它親和蛋白的能力大于NC膜，而且它根據(jù)膜的孔徑半徑分為幾種型號（4.5um/0.22um），可選擇適合的型號來轉(zhuǎn)特殊分子量的蛋白， 一般蛋白分子大于20KD選擇使用0.45um，小于20KD選擇0.22um孔徑的。 8 、配置30%SDS（聚丙烯酰胺）室溫保存，也可直接用購買的SDS試劑。 9 、APS（過硫酸銨）會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右，APS失效膠會不凝，要4℃避光保存。
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