可能原因 1：引物問題（包括：引物設(shè)計較差，引物合成較差，引物濃度太低）。

解決方法：設(shè)計引物的時候，避免在引物 3'端含有互補(bǔ)序列；避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；設(shè)計 Tm 類似的引物。針對引物合成的問題，用普通電泳法，看引物的設(shè)計和合成質(zhì)量，是否有目的條帶出現(xiàn)。最佳引物濃度介于 0.1μM 到 0.5μM 之間。

可能原因 2：探針問題。

解決辦法：就要用到我們前面提到的序列分析了。用 blast 對探針序列進(jìn)行比對，設(shè)計符合要求的探針。

可能原因 3：模板問題（包括：模板質(zhì)量不好，模板濃度太低）。

解決方法：提高模板質(zhì)量。如果懷疑模板被 DMSO 等抑制劑污染了，堅決采用乙醇沉淀；使用 104copy 的靶序列，然后在 25 到 30 個循環(huán)中獲得信號。

可能原因 4：不明物干擾。

解決辦法：做 RT-PCR 必須非常小心翼翼。對 RT-PCR 的任何實驗樣品或試劑，均應(yīng)采用“三無"離心管（即無菌無酶無熱源）進(jìn)行試劑的分裝和使用。

可能原因 5：擴(kuò)增酶問題。

解決辦法：不要省錢。買好的擴(kuò)增酶。分子生物學(xué)永遠(yuǎn)是一分價錢一分貨。推薦：選擇hot start Taq 酶進(jìn)行擴(kuò)增，可提高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素。

深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實力、壹流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。