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PCR實(shí)驗(yàn)耗材你選對(duì)了嗎？
發(fā)布時(shí)間： 2021-08-19 點(diǎn)擊次數(shù)： 4139次聚合酶鏈?zhǔn)皆谀姆磻?yīng)？
Polymerase Chain Reaction
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)？
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一項(xiàng)用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它是在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴(kuò)增至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。
影響PCR實(shí)驗(yàn)的因素之一 —— 耗材
在PCR實(shí)驗(yàn)中，影響擴(kuò)增效果的因素有很多。我們能想到的有dNTP的質(zhì)量與濃度、模板核酸的量與純化程度、引物的設(shè)計(jì)、DNA聚合酶的濃度、擴(kuò)增長(zhǎng)度等問題。
實(shí)際上，使用的耗材也可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而這往往被我們所忽略。因此在選擇實(shí)驗(yàn)耗材前，我們還需要了解PCR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語。
如何選擇合適的PCR耗材
1、原材料
PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材質(zhì)。
因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性 （可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化）。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。
2、選擇合適的容積
PCR管的體積規(guī)格大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管/板有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí)，需要避免加樣過量或過少。過量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失。
大家可依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求選用合適的產(chǎn)品。
品牌：鋼士特GUNSTER(中國(guó)臺(tái)灣)
名稱：PCR八聯(lián)排管(管蓋分離)
貨號(hào)：MB-P08B
規(guī)格：0.2ml 平蓋
品牌：鋼士特GUNSTER(中國(guó)臺(tái)灣)
名稱：PCR八聯(lián)排管(管蓋分離)
貨號(hào)：MB-P08D
規(guī)格：0.2ml 凸蓋
品牌：鋼士特GUNSTER(中國(guó)臺(tái)灣)
名稱：PCR 96孔板
貨號(hào)：MB-P96
規(guī)格：0.2ml 無裙邊 透明
3、PCR管管蓋的選擇
平蓋與凸蓋各有優(yōu)勢(shì)：
平蓋可為qPCR提供精確的熒光信號(hào)傳遞；便于書寫標(biāo)記；合蓋容易，密封性好，易于操作。
凸蓋與PCR儀熱蓋接觸，減少壓力引起的反應(yīng)管變形，更好的防止液體蒸發(fā)。但會(huì)影響熒光信號(hào)傳遞，無法應(yīng)用于qPCR實(shí)驗(yàn)。
4、96孔板裙邊的選擇
無裙邊板：可適用于大多數(shù)的PCR儀或qPCR儀，但不適用于自動(dòng)化、應(yīng)用。移液過程中穩(wěn)定性不高，需要配合板托使用。
半裙邊板：可適配標(biāo)簽或應(yīng)用條碼，適合自動(dòng)化應(yīng)用，且有著較好的移液穩(wěn)定性。
全裙邊板：非常適用于自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，也可適配標(biāo)簽及應(yīng)用條碼。機(jī)械強(qiáng)度較好，可適用于凸出模塊的PCR儀，且移液過程中穩(wěn)定性高。
5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇耗材
根據(jù)檢測(cè)方法的不同，耗材的選擇也不同。
PCR實(shí)驗(yàn)分為普通PCR法和熒光定量PCR法。普通PCR法一般是終點(diǎn)PCR跑膠法測(cè)定，所以所用耗材的導(dǎo)熱性和密封性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著密不可分的關(guān)系；而熒光定量PCR是實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，除了導(dǎo)熱性和密封性外，對(duì)透光性和避光性也有所要求。
簡(jiǎn)而言之，做熒光定量PCR的耗材也可以做普通PCR，反之則不行。
導(dǎo)熱性
導(dǎo)熱性越好越均一，PCR的速度就越快，準(zhǔn)確度也越高。
密封性
密封性越好，產(chǎn)物的揮發(fā)越少，得到的產(chǎn)物就越多，同時(shí)氣溶膠的產(chǎn)生也越少，對(duì)于下一輪實(shí)驗(yàn)的污染也就越少，也就意味著假陽性的產(chǎn)生率越低。
避光性
這是針對(duì)熒光定量而言的，如果我們?cè)谡麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒注意避光，帶有熒光的試劑過度被消耗，那直接就會(huì)影響我們實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。
透光性
這也是對(duì)于熒光定量而言，我們知道它是一種實(shí)時(shí)定量的方式，那么耗材本身的透光性就直接關(guān)系到我們檢測(cè)到的熒光信號(hào)多少。如果選擇耗材透光性良好，需要檢測(cè)到的信號(hào)就會(huì)變得微弱，那就會(huì)造成我們對(duì)結(jié)果的誤判。所以對(duì)于熒光定量而言，白色PCR板效果優(yōu)于透明PCR板。
PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用
單克隆抗體技術(shù)曾使免疫學(xué)理論與實(shí)踐有了新的突破，近幾年來PCR技術(shù)使分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科發(fā)生了一次方法學(xué)的革命。在不到10年的時(shí)間內(nèi)，在以下幾個(gè)領(lǐng)域中PCR技術(shù)已具有實(shí)用價(jià)值，且其應(yīng)用范圍正在不斷擴(kuò)大中。
1、遺傳病的產(chǎn)前診斷
用胎兒羊膜細(xì)胞，羊水或甚至母血可以檢查胎兒的性別，這在與性染色體關(guān)聯(lián)遺傳病診斷中是必要的。對(duì)于高發(fā)的遺傳病，如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏、DMD等已在臨床應(yīng)用多年，為優(yōu)生優(yōu)育作了貢獻(xiàn)，對(duì)于有遺傳傾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均是當(dāng)前研究的重點(diǎn)，近期內(nèi)可望有突破。
2、致病病原體的檢測(cè)
這些外源入侵的基因，一旦闡明其部分核酸序列，就可以設(shè)計(jì)引物或探針，用PCR、PT-PCR或雜交方法來檢測(cè)，其范圍包括細(xì)菌、病毒、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物，PCR診斷的特點(diǎn)是可以選擇其基因中的保守區(qū)作通用檢測(cè)，也可以選定差異較大的基因部位作分型檢測(cè)。既可以做一病原體的專用檢測(cè)，也可以將有關(guān)病毒、細(xì)菌中不同的品種作一次多元檢測(cè)。而且檢測(cè)的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)高于當(dāng)前的免疫學(xué)方法，所需時(shí)間也已達(dá)到臨床要求，這對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細(xì)菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。
3、癌基因的檢測(cè)和診斷
雖然對(duì)癌基因的研究大部分還屬于基礎(chǔ)階段，但癌變是由基因變異所導(dǎo)致的這一基本事實(shí)已無庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗轉(zhuǎn)移基因的研究，離開分子水平的診斷手段是無法進(jìn)行的，臨床上已可應(yīng)用的例子有白血病殘留細(xì)胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神經(jīng)質(zhì)瘤N-myc基因的激活和表達(dá)。通過原位雜交觀察特定癌基因及抗轉(zhuǎn)移基因的植入和反義寡核苷酸對(duì)強(qiáng)表達(dá)癌基因的阻斷均已成為近代基因治療的著眼點(diǎn)。
4、DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證
這一部分所矚目的課題已經(jīng)在某些國(guó)家取得法律認(rèn)可。肌紅蛋白小衛(wèi)星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復(fù)次數(shù)的差異都被應(yīng)用于鑒定，其靈敏度已達(dá)到一根頭發(fā)、一個(gè)細(xì)胞取得個(gè)體特征圖譜，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型及動(dòng)物種系的研究中。
5、動(dòng)、植物檢疫
靈敏、特異、快速診斷檢測(cè)方法是我國(guó)進(jìn)出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入國(guó)境的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國(guó)境之外，是提高我國(guó)綜合國(guó)力的必要保證。
6、高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用
在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中檢查植入基因的存在。PCR技術(shù)尚可應(yīng)用于基因拼接、測(cè)序等領(lǐng)域。
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